L'élasticité d'une seule macromolécule mesurée à l'aide d'un microscope de force atomique (AFM).

Du caoutchouc à l'ADN (Acide Desoxyribo-Nucléique).

Lorsque vous étirez un morceau de caoutchouc ou un petit élastique courant, ceux-ci peuvent s'allonger facilement de deux ou trois fois leur longueur originale. Cette propriété provient de la nature particulière de ce matériau au niveau moléculaire. Il s'agit d'un réseau de polymères flexibles enchevêtrés, reliés les uns aux autres par des jonctions permanentes (=liaisons chimiques covalentes). A température ambiante, ces polymères sont très mobiles : l'état « caoutchoutique » s'apparente, assez curieusement, à un état liquide de la matière quant au niveau important de l'agitation moléculaire des macromolécules. Les ponts chimiques (comme par exemple les ponts di-sulfures dans le caoutchouc naturel vulcanisé) conduisent à un réseau (peu dense en points de jonction) qui assure la cohésion structurale de l'ensemble : d'une part le « liquide » ne coule pas, d'autre part, il garde la mémoire de la forme initiale du morceau de caoutchouc une fois que les forces externes cessent d'être appliquées. L'élasticité extraordinaire de ce type de matériau provient de ce que les brins élémentaires du réseau sont des polymères flexibles qui, dans l'état d'enchevêtrement mutuel qui les caractérise, ont initialement une structure de pelote qui peut être allongée facilement de façon importante en déroulant la pelote (voir figure ci-contre), ceci grâce à leur flexibilité interne qui résulte, au niveau moléculaire, de la rotation possible d'une partie de la macromolécule par rapport à l'autre autour de liaisons covalentes de leur squelette.

Si le matériau est soumis à ses extrémités à une force de traction progressive de plus en plus grande, il arrive un stade, bien avant toute rupture intrinsèque, où il devient nettement plus difficile de l'allonger encore de façon appréciable. Cela est dû à ce que certains brins de polymères ont acquis, suite à la déformation globale du matériau, une structure linéaire étendue où la distance entre les extrémités du polymère est proche de sa valeur maximale dite « longueur de contour L_c» (voir figure ci-contre).

Dans ce texte, notre propos est de s'intéresser, non plus au caoutchouc, mais aux propriétés d'élasticité d'une seule macromolécule. Ce sujet est très étudié en recherche fondamentale aujourd'hui pour deux raisons différentes :

1. les physiciens ont réussi, depuis moins de 10 ans, à mettre au point diverses méthodes expérimentales permettant de mesurer directement la loi qui relie l'allongement d'une macromolécule unique à l'intensité des forces égales et opposées appliquées aux extrémités de celle-ci. La prouesse est également chimique car il faut attacher (greffer par un lien covalent) chaque extrémité de la macromolécule à l'agent extérieur à l'aide duquel la force de traction sera transmise au sein de la macromolécule.
2. Les chercheurs en biologie moléculaire s'intéressent à un grand nombre de macromolécules biologiques spécifiques dont ils essaient de comprendre, pour certaines d'entre elles, leurs propriétés mécaniques. Le cas le plus étudié est l'ADN car la lecture des bases (code de l'information génétique) requiert l'ouverture des deux brins de la double hélice : ceci est notamment rendu possible dans les cellules par l'action de protéines spécifiques qui « tordent » ou  « tirent » l'ADN localement afin de casser les liaisons entre bases conjuguées. Par ailleurs, de nombreuses protéines possèdent elles-mêmes des propriétés mécaniques spécifiques qui sont utiles à leur fonction (tels l'actine et la titine dans les muscles ou la ténascine sur les parois des vaisseaux sanguins,...). Ces aspects biologiques feront l'objet d'un second texte.
   

Dans le cas présent, nous resterons en dehors de tout contexte biologique afin de nous concentrer, dans un premier temps, sur la loi d'élasticité d'une macromolécule unique de type polymère, tant au niveau du concept lui-même que de sa mesure expérimentale. De façon générale, ce sujet est lié à l'énergie dans le sens que tirer sur une molécule demande du travail. Quand elle est étirée, une molécule a absorbé de l'énergie qu'elle stocke sous forme d'énergie potentielle comme le ferait un ressort !

Loi d'élasticité d'un polymère (le point de vue du physicien)

Un polymère est une macromolécule de structure chimique régulière obtenue en polymérisant un grand nombre de fois un même monomère. L'exemple le plus simple nous suffira ici : le polyethylène est un hydrocarbure de formule chimique CH₃-(CH₂-CH₂-)_n-CH₃, où n est le degré de polymérisation qui est de l'ordre de 100 à 10000. Le nom de ce polymère vient de ce qu'il est synthétisé par la polymérisation linéaire de l'éthylène CH₂=CH₂.

Voyons comment se comporte, du point de vue physique, un polymère unique baignant au sein d'un solvant lorsqu'on exerce des forces égales et opposées à ses extrémités. La loi d'élasticité traduira la façon dont la distance bout à bout moyenne de ce polymère -soit R- va croître progressivement avec l'intensité de la force -soit f- exercée à ses extrémités.

Pour analyser la fonction f = g(R) ou la relation inverse R = h(f) = g^-1(f), introduisons les trois variables physiques relevantes du modèle d'un polymère, à savoir L_c, . et k_BT. Rappelons que L_c est la longueur de contour du polymère soit, dans notre exemple, 0,254 nm (pour rappel, 1 nm = 1 10-9m = 0,001 mm) par monomère d'éthylène au sein du polyéthylène, ce qui conduit à Lc = 2540 nm pour le cas ou le degré de polymérisation est n = 10000. La longueur porte le nom de longueur de persistance : elle traduit la longueur, mesurée le long du contour du polymère, dont il faut se déplacer pour que, en moyenne, l'orientation locale du polymère (définie par l'orientation de la tangente au contour en un point) a « oublié » son orientation initiale (voir figure 2). Pour les polymères dits flexibles, semi-flexibles et rigides, on a respectivement L_c >> , L_c = et L_c << . Notons que = 0,7 nm pour le polyéthylène, ce qui montre qu'il s'agit d'un polymère flexible. Enfin, k_BT est le produit de la température absolue T du liquide dans lequel baigne notre macromolécule par la constante fondamentale de Boltzmann (constante des gaz parfaits divisée par le nombre d'Avogadro) k_B = 1,38 10^-23 J/K (joules par degré Kelvin). L'énergie 1/2 k_BT est l'énergie cinétique moyenne associée à un degré de liberté microscopique classique, traduisant le fait que la température absolue est une mesure de l'agitation moléculaire. Dans un liquide formé de petites molécules rigides, k_BT est de l'ordre de l'énergie de cohésion entre une paire de molécules, ce qui explique que des paires de molécules au sein d'un liquide s'associent et se défont continuellement. Cette image reste valable pour les polymères en phase liquide au niveau des fragments moléculaires qui forment la chaîne. Notons encore ici un point préliminaire important concernant la taille moyenne R₀ d'un polymère flexible libre au sein d'un liquide, définie telle que R₀² soit la moyenne du carré de la distance bout à bout du polymère qui, au sein du liquide, change perpétuellement sa conformation. Un calcul statistique montre que la taille moyenne est liée aux grandeurs introduites plus haut par la relation R₀ = (2Lc)1/2, ce qui donne R₀ = 62 nm dans le cas du PE de degré de polymérisation n = 10000. Remarquons que cela implique que la taille d'un polymère augmente avec n selon une loi où R₀ est proportionnel à n^1/2.

A partir des trois paramètres, Lc, et kBT, on peut définir deux forces typiques. La force f' = k_BT/R₀ est la force seuil qu'il faut appliquer pour observer un allongement plus important que l'allongement naturel d'équilibre R₀. La force f'' = k_BT/b où b = 2 représente le seuil qu'il faut appliquer pour voir la structure locale se déformer appréciablement : ceci signifie qu'un élément de la chaîne de longueur b, qui se comporte comme un segment assez rigide au sein de la pelote, commence lui-même à être étiré ! Si l'on augmente progressivement la force f entre les limites f' et f'', le polymère se déroule de plus en plus. Pour un polymère étiré au sein d'un milieu approprié (càd un milieu solvant ? dont la description nous entraînerait trop loin ici), la relation entre f et R est linéaire si f' < f < f'' et on démontre que le polymère se comporte comme un ressort avec une loi de type f = kR où la « constante de rappel » est k = 3kBT/R02. Pour f > f'', le polymère étant pratiquement déroulé, c'est le squelette de la chaîne qui, à son tour, commence à être étiré. Les angles de torsion (qui sont à la base de la flexibilité des polymères) vont réagir aux forces de tension internes en adoptant préférentiellement les conformations qui correspondent à une extension maximale du monomère au sein du squelette du polymère. Dans l'exemple du PE, cela se traduira par une proportion croissante de conformations en trans aux dépens des conformations gauche.

La figure 3 ci-contre représente schématiquement la loi d'élasticité d'une chaîne unique de type PE sous la forme f = g(R). Remarquons que pour le PE, on a f' = 0,07 pN (piconewton, soit 10^-12 N) pour n = 10000 et 0,7 pN pour n = 100 alors que f'' = 2,8 pN. La constante de rappel effective du PE (n = 10000) est de k = 3,2 10^-6 N/m. Quand on tire sur le PE de n = 10000 avec une force croissante entre 0,07 et 3 pN, la distance bout à bout moyenne augmente de 62 à 875 nm alors que Lc = 2500 nm. La figure 3 montre que la force augmente rapidement si on veut étirer le polymère au delà de R = f''/k. On parle de la région f > f'' comme la région de flexibilité finie du polymère car ce dernier cesse de se comporter comme un ressort ! L'énergie stockée dans un polymère étiré de R < f''/k est E = 1/2 k R², soit environ 1. 10^-18 J pour R = 875 nm dans l'exemple du PE avec n = 1000. Au delà de cet étirement, l'énergie (et donc le travail d'extension) augmente plus rapidement avec R comme on l'avait en fait implicitement remarqué au début de ce texte avec l'extensibilité du caoutchouc qui devient plus difficile au-delà d'une certaine limite.

Le microscope de force atomique (utilisé pour déterminer la loi d'élasticité d'une macromolécule unique)

La technique décrite ici est une application très particulière du microscope de force atomique (AFM pour « Atomic Force Microscope ») dont l'invention remonte seulement à quelques 15 années environ et qui est actuellement utilisé selon différents modes opératoires pour étudier principalement des surfaces. La figure 4 montre les éléments importants de l'appareil ainsi que le dispositif utilisé pour mesurer l'élasticité d'une macromolécule. L'élément central est un micro-levier en forme de « V » qui se termine, sur sa face inférieure, par une pointe dont l'extrémité possède un rayon de courbure de quelques dizaines de nm. Les interactions entre cette pointe et les molécules tapissant ou formant la surface libre de l'échantillon vont créer une déflexion du micro-levier vers le bas (en cas d'attraction) ou vers le haut (en cas de répulsion). Cette déflexion est mesurée grâce à quatre photodiodes qui reçoivent une fraction du rayon laser réfléchi par le dos du micro-levier.

En absence d'interaction, le rayon est initialement bien centré, et chaque quadrant (= une photodiode) reçoit la même quantité de lumière (nombre de photons par unité de temps). Toute déflexion vers le haut ou le bas du micro-levier sera détectée par un déséquilibre de la quantité de lumière reçue par les quadrants du haut et du bas. Afin de relier cette déflexion à une différence de hauteur absolue de la pointe, représentons la hauteur absolue (suivant la verticale) de la base de la pointe par z_eq en absence d'interactions et par z en présence d'une force (attractive pour z > z_eq ou répulsive pour z < z_eq). La force appliquée au levier est alors donnée par f = k'(z-z_eq) où k' est le coefficient de raideur du micro-levier. Cette constante (de l'ordre de 0,1 N/m) est obtenue à partir de la déflexion du rayon lumineux suite à un calibrage préliminaire.

La position verticale de la surface, représentée par z_s, peut être modifiée pour approcher ou reculer la surface par rapport à la pointe, la distance d = z_s-z, étant donc la distance entre pointe et surface. La hauteur de la surface est actionnée par un cristal piezo-électrique situé sous la surface : un tel cristal est un mono-cristal dont les dimensions de la maille cristalline varient avec l'intensité du champ électrique imposé qui est sous contrôle de l'opérateur. Sur la figure 5 (à gauche), une molécule unique est fixée avec une extrémité sur la pointe et l'autre sur la surface. On suppose généralement (ce qui est difficile à contrôler en réalité) que les points de greffage du polymère sur la pointe et sur la surface sont à la verticale l'un de l'autre ce qui implique qu'ils sont effectivement séparés selon z par la distance bout à bout R du polymère, soit R = d = z_s-z.

Les relations de base sont :

1) La loi d'élasticité de la macromolécule recherchée f = g(R) (1)

2) La loi d'élasticité du micro-levier f = k' (z-z_eq) (2a)

que l'on peut réécrire f = - k' R + k' (zS-z_eq) (2b)

Les équations (1) et (2b) doivent en fait être simultanément satisfaites pour une valeur particulière de la position z_s - z_eq, contrôlée par le cristal piezo-électrique.

La figure 6 représente la résolution graphique de ce système de deux équations à deux inconnues pour (z_s - z_eq) fixé. La courbe représentant la loi f = g(R) typique d'un polymère de synthèse a été discutée dans le paragraphe II (voir figure 3). La relation 2b est une droite f = aR+b dont la pente est a = -k' et l'ordonnée à l'origine b = k' (z_s - z_eq). L'ordonnée à l'origine peut s'interpréter comme la force nécessaire pour plier le levier de telle sorte que la pointe soit au niveau de la surface, en absence de toute interaction avec celle-ci. Par ailleurs, cette droite coupe l'axe des abscisses en R = (z_s - z_eq). Le point recherché est donné par l'intersection des deux courbes, soit la paire {f*, R*} indiquée sur la figure 6. En consultant les valeurs sur l'axe des abscisses, on constate, en accord avec les relations 2a et 2b, que la distance imposée (z_s - z_eq) est décomposée en deux parties, soit la longueur bout à bout R* du polymère et la déflexion du levier (z - z_eq) = f*/k'. Lorsque la distance imposée (z_s - z_eq) est modifiée par l'opérateur, la droite de pente constante (a = -k') se déplace parallèlement à elle-même et le dispositif expérimental fournit en principe les points {f , R} de la courbe.

Expérimentalement, on ajuste z_s (contrôlé avec une précision finie Dz) et on mesure f* avec une précision Df . Sur base de ces mesures, on tire une estimation de R* à partir de l'équation 2b. Il faut savoir que k' est au minimum de 0,01 N/m, ce qui est toujours nettement plus grand que la constante de rappel effective du polymère k (notion valable dans la région f < f'') qui est de l'ordre de 1,0 10^-5 N/m. A 300 K, avec un levier de constante de raideur k' = 0,1 N/m, on peut montrer qu'un bruit (dû à l'agitation thermique affectant le microlevier) d'amplitude A = 0,2 nm affecte la valeur de z, ce à quoi correspond une incertitude de Df = 20 pN. Comme la force f'' qui fait la transition entre domaine linéaire et domaine de flexibilité finie (voir figure 3) est de 3 pN, on se rend compte que l'AFM ne pourra être utilisé que pour mesurer la région dite de flexibilité finie de la loi d'élasticité.

La figure 7 donne un exemple de courbe expérimentale obtenue dans le cadre de l'étirement d'un polymère. Dans cet exemple, z_F en ordonnée représente une mesure proportionnelle à la force, soit z_F = -(z-z_eq) alors qu'en abscisse, z_P = z_s - z_eq + C où C est une constante (voir sens physique plus bas), donne la déflexion globale du système total « levier + macromolécule en série ». La courbe en gris clair représente la courbe d'approche où la pointe se rapproche de la surface sur laquelle est greffé le polymère. Le contact direct pointe-surface s'établit et la pointe (+ levier) s'élève vu la répulsion qu'exerce sur elle la surface dure (z_F > 0). Lorsque le cristal piezo-électrique commande à la surface de s'éloigner à nouveau de la pointe, il s'est produit une adsorption physique du polymère sur la pointe (voir dessin explicatif dans la figure 5) et l'appareil, en mesurant la courbe de rétraction de la pointe, teste à présent la force d'attraction entre la pointe et la surface résultant du pont flexible provenant du polymère (courbe en noir). On observe sur la courbe de rétraction que lorsque z_P atteint 80 nm, la force de 500 pN devient suffisamment importante pour détacher le polymère de la pointe qui redevient libre. La constante C permet en fait de définir la position absolue de la surface, plus exactement le point d'ancrage du polymère sur la surface : ce point est délicat car, quand on travaille au niveau microscopique, le concept géométrique d'une surface plane à l'interface de l'échantillon et du solvant environnant est mal défini. La situation est en fait rendue très complexe car il y a des interactions atome-atome de tout ordre (attractives et/ou répulsives) quand il y a contact direct entre pointe et surface. Dans le cas de la figure 7, on peut faire l'hypothèse simpliste que le cas z = z_eq correspond au cas où la surface est à hauteur z_s = z = z_eq. Sur la figure 7, cela se produit pour z_P = 10 nm, ce qui fixe C à cette même valeur.

En pratique, la technique exposée permet donc d'étudier la loi d'élasticité de polymères de synthèse ou de molécules biologiques dans la partie correspondant au domaine dit d'extension finie (non linéaire). Pour étudier la loi d'élasticité de macromolécules uniques à plus faible force, il faut recourir à d'autres techniques où la macromolécule est greffée à une extrémité à une surface et à l'autre à une bille (de l'ordre du micron), éventuellement magnétisée, que l'on manipule avec des pinces optiques (faisceau laser) ou magnétiques (champ magnétique).

Références :

«Force spectroscopy on single passive biomolecules and single biomolecular bonds»,
R. Merkel,
Physics Reports
(2001) 346, 343-385.

«The manipulation of single biomolecules»,
T. Strick, J.-F. Allemand, V. Croquette, D. Bensimon,
Physics Today
(2001), 54, 46

L'intérêt primordial de ce type de mesure sur les polymères est de mettre au point une technique permettant d'aller plus loin encore en étudiant des molécules d'intérêt biologique dont la structure interne peut être révélée par des mesures mécaniques directes. Ce sujet est abordé dans un autre texte de cette série. Par ailleurs, on étudie même aujourd'hui des réactions chimiques spécifiques au sein d'un double brin d'ADN unique en suivant les modifications de longueur de la molécule induites par la réaction. Pour ceux qui voudraient en savoir plus, nous citons à la fin du texte deux références récentes qui donnent un aperçu de la révolution dans l'instrumentation des micromanipulations et son impact en biologie.

L'AFM dont il a été fait état ici est un instrument dont l'utilisation ne cesse d'être raffinée et étendue. Notre laboratoire en Faculté des Sciences (Physique des Polymères) en possède un exemplaire avec four thermique permettant d'étudier des surfaces de matériaux en fonction de la température. Le laboratoire sera accessible aux personnes intéressées, sur rendez-vous (02/650 5732 le matin) durant la période du Printemps des Sciences.

Remerciements :

Je tiens à remercier mes collègues Marc Baus et Dimitri Ivanov pour leurs suggestions et conseils dans l'élaboration de ce texte.