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Amélioration de la résolution spatiale en microscopie multiphotonique par saturation de la fluorescence

Dans le cadre de ce projet, nous nous proposons de développer une méthode permettant d'améliorer sensiblement la résolution spatiale en microscopie multiphotonique en se basant sur l'effet de saturation du signal de fluorescence. Une méthode similaire a récemment été proposée dans la littérature dans le contexte de la microscopie confocale. Il peut paraître paradoxal que la saturation du signal de fluorescence puisse améliorer la résolution spatiale. En effet, en première analyse, celle-ci devrait conduire à une déformation de la PSF par rapport au cas non saturé et donc à une diminution de la résolution spatiale. Cependant, lorsque le signal d'illumination est modulé périodiquement à la fréquence w et que l'amplitude crête du signal de modulation est suffisante pour entrer en régime de saturation du signal de fluorescence, des harmoniques d'ordre supérieur (2w, 3w,...) vont apparaître dans le signal de fluorescence. Ces harmoniques seront présentes dans le signal de fluorescence modulé parce que la relation entre l'intensité d'illumination et l'intensité de fluorescence n'est plus linéaire lorsque l'on s'approche du régime de saturation. Ainsi, si la démodulation du signal de fluorescence se fait non pas sur la première harmonique mais sur une harmonique supérieure (p.ex. 2w), il est possible de montrer que la résolution spatiale, tant axiale que latérale, est améliorée, car le signal harmonique est préférentiellement généré au centre de la fonction d'étalement du point. [Dans le cadre de ce projet, nous nous proposons de développer une méthode permettant d'améliorer sensiblement la résolution spatiale en microscopie multiphotonique en se basant sur l'effet de saturation du signal de fluorescence. Une méthode similaire a récemment été proposée dans la littérature dans le contexte de la microscopie confocale. Il peut paraître paradoxal que la saturation du signal de fluorescence puisse améliorer la résolution spatiale. En effet, en première analyse, celle-ci devrait conduire à une déformation de la PSF par rapport au cas non saturé et donc à une diminution de la résolution spatiale. Cependant, lorsque le signal d'illumination est modulé périodiquement à la fréquence w et que l'amplitude crête du signal de modulation est suffisante pour entrer en régime de saturation du signal de fluorescence, des harmoniques d'ordre supérieur (2w, 3w,...) vont apparaître dans le signal de fluorescence. Ces harmoniques seront présentes dans le signal de fluorescence modulé parce que la relation entre l'intensité d'illumination et l'intensité de fluorescence n'est plus linéaire lorsque l'on s'approche du régime de saturation. Ainsi, si la démodulation du signal de fluorescence se fait non pas sur la première harmonique mais sur une harmonique supérieure (p.ex. 2w), il est possible de montrer que la résolution spatiale, tant axiale que latérale, est améliorée, car le signal harmonique est préférentiellement généré au centre de la fonction d'étalement du point.]



responsable


Simon-Pierre GORZA


équipe


Michaël FITA CODINA


disciplines et mots clés déclarés


Biophysique Optique Sciences de l'ingénieur

biophotonique multiphoton résolution sax microscopie